摘要：建立了一种利用胃蛋白酶在酸性条件下酶切,结合柱后在线还原法和液相色谱-质谱联用系统分析蛋白质二硫键的方法。在酸性体系中,采用胃蛋白酶水解蛋白质,能够最大限度地维持蛋白质二硫键的原有构象;柱后在线还原法的应用能够弥补胃蛋白酶酶切位点专一性差、数据解析困难等不足。本研究将二者相结合并成功用于分析重组人粒细胞刺激因子(rhG-CSF)的二硫键和未配对半胱氨酸。实验结果表明,采用本方法测得经N-乙酰马来酰亚胺烷基化处理的rhG-CSF中二硫键配对方式为Cys36-Cys42和Cys64-Cys74,Cys17全部被烷基化试剂结合,且未检测到二硫键错配,实现了二硫键的完全定位。不经过烷基化处理,采用本方法测得rhG-CSF中Cys36-Cys42、Cys64-Cys74和Cys17的错配比例分别为9.1%、0%和12.6%;基于胰凝乳蛋白酶的常规方法检测到的二硫键错配比例依次为73.4%、58.1%和97.5%;采用Glu-C和胰蛋白酶联合酶解的常规方法检测到的错配比例依次为40.3%、5.2%和22.3%。与常规方法相比,本方法检测到的二硫键错配比例更低,测定结果能够更准确地反映二硫键在蛋白分子内的实际存在状态。